Nenehni vdori španskega osvajalca Don Nuño Beltrána de Guzmana proti zahodnim deželam države, da bi povečali njegovo oblast in moč na teh ozemljih, so povzročili ustanovitev nove pokrajine, imenovane Kraljevina Nova Galicija.
V regiji so živele različne avtohtone skupine, ki so nenehno pustošile po naseljih, ki so jih v njej ustanavljali Španci. Poročnik Nuño de Guzmána, kapitan Juan B. de Oñate, je prejel ukaz, naj pomiri te pokrajine in naj ustanovi Villa de Guadalajara v kraju Nochistlán, kar je končal 5. januarja 1532. Zaradi pogostih napadov avtohtonih prebivalcev na mesto leto kasneje se je moral preseliti v Tonalá in kasneje v Tlacotlán. Tretji prenos je bil opravljen za naselje mesta v dolini Atemajac, kjer je bilo mesto dokončno ustanovljeno 14. februarja 1542 ob prisotnosti Cristóbala de Oñateja kot guvernerja Nove Galicije in don Antonia de Mendoze, takratni podkralj Nove Španije, ki je Miguela de Ibarro imenoval za župana in namestnika guvernerja.
Mesto se je hitro razvijalo in začelo tekmovati z mestom Compostela (danes Tepic), ki je bila takrat sedež verskih in civilnih oblasti, tako da so prebivalci Guadalajare izvajali tak pritisk na oblasti Audiencia, da je kralj Felipe II se je odločil izdati potrdilo z dne 10. maja 1560 o selitvi iz Compostele v Guadalajaro, katedralo, kraljevo sodišče in uradnike zakladnice.
Urbana struktura je bila načrtovana v skladu s strukturo drugih kolonialnih mest, zato je bila njena postavitev razvita v obliki šahovnice s trga San Fernando. Kasneje je soseski Mexicaltzingo in Analco ustanovil Fray Antonio de Segovia in sosesko Mezquitán, eno najstarejših. Postavljene so bile tudi hiše v mestni hiši, nasproti sedanjega templja San Agustín in prve župnijske cerkve, v kateri je palača pravičnosti.
Danes čudovito mesto, bogato s kolonialnimi zgradbami, razstavlja veliko ustreznih arhitekturnih primerov, kot je katedrala, ki jo je treba videti, ki jo je med letoma 1561 in 1618 zgradil arhitekt Martín Casillas. Njegov slog je bil uvrščen med začetnike baroka. Njegova trdna zgradba se dviga pred današnjo tržnico Plaza de Guadalajara s svojimi radovednimi stolpi, ki so, čeprav ne spadajo v prvotni slog stavbe, trenutno prepoznani kot simbol prestolnice Guadalajare. Primitivne stolpe je v devetnajstem stoletju uničil potres, zato so dodali tiste, ki jih ima danes. Notranjost templja je v polgotskem slogu, vključno s trezorji iz čipke.
Drugi verski kraji iz 16. stoletja so samostan San Francisco, ustanovljen leta 1542 blizu reke v soseski Analco in skoraj popolnoma uničen v reformaciji. Ohranjen je njegov tempelj, obnovljen konec 17. stoletja z baročno fasado skromnih salomonskih linij. Samostan San Agustín je bil leta 1573 ustanovljen s kraljevim odlokom Felipeja II in trenutno ohranja svoj tempelj s fasado hudih herrerskih linij in notranjostjo z rebrastimi oboki.
Santa María de Gracia, drugo samostansko osnovo, so zasedle dominikanske redovnice iz Pueble, zgrajene leta 1590 pred Plaza de San Agustín, plačal pa Hernán Gómez de la Peña. Zgradba je zasedla šest blokov, čeprav danes še vedno obstaja samo njen tempelj, z neoklasično fasado iz druge polovice 18. stoletja.
